فهرست مطالب

عنوان صفحه

چکیده1

فصل اول. 2

کلیات 2

1ـ 1 مقدمه. 3

1ـ 2 تاريخچه باکتري استافيلوکوکوس.. 3

1ـ 3 جنس باکتري استافيلوکوکوس:5

جدول 1ـ 1) نحوه کلونيزاسيون و بيماريزائي استافيلوکوکوس در انسان (4)6

1ـ 4 طبقه بندي. 7

جدول 1ـ 2) مقايسه خصوصيات سه گونه استافيلوکوکوس مهم پزشکي (22)7

1ـ 5 مورفولوژي سلول. 8

1ـ 6 خصوصيات کشت.. 8

1ـ 7 متابوليسم. 9

1ـ8 تنفس... 10

1ـ 9اپيدميولوژي. 10

1ـ 10 خصوصيات ژنتيکي. 11

1ـ 11 بيماري زايي. 12

1ـ 12تشخيص آزمايشگاهي. 14

1ـ 12ـ 1 نمونه برداري:14

1ـ 12ـ 2 کشت و رنگ آمیزی گرم14

1ـ 12ـ 3 آزمایشات تفکیکی. 15

1ـ 13 درمان. 15

جدول 1ـ 3) رژيم درماني عفونت‌هاي ايجاد شده توسط استافيلوکوکوس هاي مقاوم به متي سيلين (5،34)16

1ـ 14 مقاومت به عوامل ضد ميکروبي. 17

1ـ 14ـ 1 مقاومت به متي سيلين. 18

1ـ 14ـ 1ـ 1 تاريخچه و اپيدميولوژي. 18

شکل 1ـ 1) مکانيسم انتقال افقي ژن mecA به ساير باکتري‌ها.19

1ـ 14ـ 2 خصوصيات مقاومت به متي سيلين. 20

1ـ 14ـ 2ـ 1 مقاومت هتروژنوز (Heterogeneous resistance):20

1ـ 14ـ 2ـ 2 مقاومت هموژنوز(Homogenous resistance)20

جدول 1ـ 4) مشخصات مربوط به مقاومت به متي سيلين در استافيلوکوکوس (34)21

1ـ 14ـ 3 روش‌هاي تشخيص مقاومت به متي سيلين. 21

1ـ 14ـ 3ـ 1 روش‌هاي فنوتيپي. 21

1ـ 14ـ 3ـ 1ـ 1 Disk diffusion. 21

1ـ 14ـ 3ـ 1ـ 2 Broth microdilution. 22

1ـ 14ـ 3ـ 1ـ 3 Agar screen. 23

جدول 1ـ 5) تست‌هاي حساسيتي توصيه شده براي استافيلوکوک‌های کوآگولاز منفی و استافيلوکوک اورئوس مقاوم به متي سيلين (34)24

1ـ 14ـ 3ـ 2روش‌هاي مولکولي. 24

1ـ 14ـ 3ـ 2ـ 1 استخراج DNA (DNA extraction)25

1ـ 14ـ 3ـ 2ـ 2شکستن سلول (Cell lysis)25

1ـ 14ـ 3ـ 2ـ 3 رسوب DNA(DNA Sedimentation)25

1ـ 14ـ 3ـ 2ـ 4 تخلیصDNA (Purification of DNA)26

1ـ 14ـ 3ـ 2ـ 5 رسوب پروتئين‌ها (Sedimentation of proteins)26

1ـ 14ـ 3ـ 2ـ 6 جدا کردن DNA از RNA.. 26

1ـ 14ـ 3ـ 3PCR (Polymerase Chain Reaction)26

1ـ 14ـ 3ـ 3ـ 1 اصول کلي انجام PCR.. 27

1ـ 14ـ 3ـ 3ـ 2 انواع مختلف PCR.. 28

1ـ 15 بررسي متون. 28

1ـ 16 اهميت پژوهش... 31

فصل دوم. 33

مواد و روش ها33

2ـ 1 نوع پژوهش... 34

2ـ 2 جمعيت مورد مطالعه. 34

2ـ 3 معيار ورود به مطالعه. 34

2ـ 4 معيار خروج از مطالعه. 34

2ـ 5 روش نمونه گيري. 34

2ـ 6 مکان وزمان تحقيق. 34

جدول 2ـ 1) متغيرها35

2ـ 7 روش جمع آوري نمونه‌ها35

2ـ 8 محدوديت‌هاي تحقيق. 36

جدول 2ـ 2)لیست دستگاه‌هاي مورد استفاده37

جدول 2ـ 3) مواد و محیط‌های کشت لازم جهت تشخیص استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس وساپروفیتیکوس 38

2ـ 9 مواد و محيط‌هاي کشت جهت جداسازي و تشخيص... 38

2ـ 9ـ 1 محيط کشت تريپتيکاز سوي براث TSB ( Trypticase Soya Broth)38

2ـ 9ـ 2 محيط کشت بلاد آگار (Blood Agar)39

2ـ 9ـ 3 محيط کشت دوفازی خون. 39

2ـ 9ـ 4 آب اکسيژنه. 40

2ـ 9ـ 5 پلاسماي ليوفيليزه خرگوش.. 40

2ـ 9ـ 6 مواد ومحلول‌هاي رنگ آميزي گرم40

2ـ 9ـ 7 دیسکهای لازم برای تفکیک.. 40

جدول 2ـ 4) لیست مواد و محیط‌های کشت جهت آنتی بیوگرام40

2ـ 10 مواد و محيط‌هاي کشت جهت تعيين مقاومت آنتي بيوتيکي. 41

2ـ 10ـ 1 محيط مولر هينتون آگار(Mueller Hinton Agar)41

2ـ 11 مواد و محيط‌هاي کشت لازم جهت نگهداري سويه‌هاي جمع آوري شده41

2-12 کشت و جداسازي و تعيين هويت باکتري‌ها42

2ـ 13 آزمايشات لازم جهت تشخيص افتراقي استافيلوکوکهای اپیدرمیدیس وساپروفیتیکوس.. 42

2ـ 13ـ 1 تست کاتالاز. 42

2ـ 13ـ 2 تست کواگولاز. 43

2ـ 14 تست بررسی مقاومت به متی سیلین به روش فنوتیپی (Disk diffusion)44

2ـ 15 روش مولکولي جداسازي ژن mecA.. 44

2ـ 15ـ 1 استخراج DNA.. 44

2ـ 15ـ 2 بررسي کمي و کيفي DNA استخراج شده45

جدول 2ـ 5)مواد و وسايل مورد نيازجهت انجامPCR و الکتروفورز. 46

2ـ 16 طراحي، ساخت و آماده سازي پرايمرها47

جدول 2ـ 6) پرايمرهاي مورد استفاده برای انجام Multiplex PCR.. 47

2ـ 17 روش انجام PCR بر روي نمونه‌ها47

جدول 2ـ 7) غلظت و مقادير به کار رفته براي هر نمونه در واکنش Multiplex PCR.. 48

جدول 2ـ 8) برنامه دمايي دستگاه ترموسايکلر براي انجام واکنش زنجيره اي پليمراز Multiplex PCR))49

2ـ 18 الکتروفورز محصول PCR و عکسبرداري از آن. 49

2ـ 18ـ 1 ژل پلي اكريل آميد. 49

2ـ 18ـ 2بافر الكتروفورز. 50

2ـ 18ـ 3 بافر لودينگ.. 51

2ـ 18ـ 4 مواد و ساخت ژل پلي اكريل آميد. 51

2ـ 18ـ 4ـ 1 طرز ساخت ژل پلي آکريل آميد. 52

2ـ 18ـ 4ـ 2 بارگذاري محصولات PCR درون ژل. 52

2ـ 18ـ 5 انجام الکتروفورز. 53

2ـ 18ـ 6 رنگ آميزي ژل پلي اکريل آميد با نيترات نقره و مشاهده باندهاي DNA.. 54

فصل سوم. 55

نتایج55

3ـ 1 نتایج. 56

جدول 3ـ 1:فراوانی ودرصد نوع نمونه. 56

3ـ 2 بررسی فراوانی نوع نمونه. 56

جدول 3ـ 2: فراوانی استافیلوکوکوس‌های اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس در بیمارستان‌ های هاجر(س) و آیت الله‌کاشانی 57

3ـ 3 بررسی فراوانی استافیلوکوکوس‌های اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس در بیمارستان‌ هاجر(س) و آیت الله کاشانی 57

3ـ 4بررسي شيوع مقاومت فنوتیپی و ژنوتیپی (شيوع ژن mecA)57

جدول 3ـ 3: فراوانی مقاومت به متی سیلین و شیوع ژن mecA در بیمارستان های هاجر(س) و آیت الله کاشانی 58

جدول 3ـ 4 نتایج آنتی بیوگرام (فراوانی مقاومت به متی سیلین و وانکومایسین)59

شکل 3ـ 1)نمایی از ژل رنگ آمیزی شده پلی اکریل آمید حاوی ژن‌های mecA و16S rDNAبه ترتیب از چپ به راست: ستون 1 مارکر وزنی(100bp) ، ستون 2کنترل مثبت(Staphylococcus AureusATCC 33591)، ستون‌های 3تا 6 نمونه‌های مثبت از نظر وجود هر دو ژنmecA و16S rDNA، ستون 7 کنترل منفی، ستون 8 تا 11 نمونه مثبت از نظر وجود ژن 16SrDNA و منفی از نظر وجود ژن mecA.60

شکل 3-2) تعیین توالی محصول PCR خالص شده یکی از ایزوله های استافیلوکوکوس.. 61

فصل چهارم. 62

بحث و نتیجه گیری. 62

4ـ 1 بحث.. 63

4ـ 2محدوديت‌هاي تحقيق. 70

4ـ 3 پيشنهاد‌ها71

4ـ 4 نتیجه گیری. 71

پیوست ها73

منابع 74

 

چکیده

مقاومت به متي سيلين در استافيلوکوکوس ها هنگامی ایجاد مي‌شود که ژن mecA وجود داشته باشد. اين ژن، PBP2a را کد مي کند که یک پروتئين متصل شونده به پني سيلين با تمايل پايين است. به دلیل توجه به مهمترین عامل بیماریزای این جنس یعنی استافیلوکوکوس اورئوس، گاهی گونه‌های کوآگولاز منفی کمتر مورد توجه قرار مي‌گیرند و این در حالی است که دو گونه دیگر یعنی استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس فرصت طلب هستند و در شرایط مناسب مي‌توانند بیماریزا و همچنین عامل عفونتهای بیمارستانی باشند و نکته مهمتر اینکه مقاومت به عوامل ضد میکروبی گاهی در استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس شیوع بالاتری نسبت به استافيلوکوکوس اورئوس دارد. از طرف دیگر عامل ژنتیکی مقاومت به متی سیلین (ژن mecA) جزو عوامل ژنتیکی متحرک مي‌باشد که به عنوان یک ذخیره ژنی، قابلیت انتقال به استافیلوکوکوس اورئوس را دارد. بنابر این هدف از اين مطالعه بررسی میزان مقاومت به متی سیلین در ايزوله‌هاي استافيلوکوکوس‌های اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس جدا شده از نمونه‌هاي باليني بيمارستان‌هاي آموزشي شهرکرد با روشMultiplex PCR بود.

مواد و روشها: در این مطالعه توصیفی-تحلیلی تعداد 2900 نمونه مختلف شامل خون، ادرار و غیره از بیماران بستری در بیمارستان‌ های هاجر (س) و آیت الله کاشانی شهرکرد جمع آوری شد. به منظور جداسازی و شناسایی استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس، نمونه‌ها بر روي محيط بلاد آگار کشت داده شدند. استافیلوکوکوس‌های کوآگولاز منفی با رنگ آمیزی گرم، تست‌های کاتالاز و کواگولاز لوله اي مشخص شدند. متعاقباً برای تفکیک ايزوله‌هاي استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس، تست‌های اکسیداز، بررسی حساسیت به باسیتراسین و نووبیوسین مورد استفاده قرار گرفت. به این ترتیب تعداد 150 ایزوله استافیلوکوکوس‌های اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس انتخاب شد. در مرحله بعد باکتري‌هاي مزبور با استفاده از روشDisk diffusion به منظور تعيين حساسيت به متی سیلین مورد بررسي قرار گرفتند. سرانجام هر ایزوله از نظر حضور ژن mecA و16SrDNA با روش Multiplex PCR مورد ارزیابی قرار گرفت.

يافته ها:بر اساس نتايج بدست آمده از 150 ایزوله مورد بررسی، 124 ایزوله استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و 26 ایزوله استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس بودند. تمامی 150 ایزوله با روش Disk diffusion از نظر مقاومت به متی سیلین مورد بررسی قرار گرفتند که 70 ایزوله(66/46%) مقاوم بودند. نتایج بررسی‌ها با روش Multiplex PCR نشان داد که 64 ایزوله(66/42%) از استافيلوکوکوس‌های اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس داراي ژن mecAبودند.

نتيجه­گيري:اين مطالعه نشان داد که مقاومت به متی سیلین و وجود ژن mecA در بيمارستان‌های‌هاجر و آیت‌الله کاشانی شهرکرد شیوع بالایی دارد و پیشنهاد می‌شود به منظور تشخیص سریع و دقیق مقاومت به متی سیلین از روش PCR استفاده شود.

کلمات کليدي: استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس، مقاومت به متي سيلين، Disk diffusion و Multiplex PCR.

 

 

 

 

 

فصل اول

کلیات

 

 

 

 

 

 

 

1ـ 1 مقدمه

اصطلاح عفونتهای بيمارستاني در طي سال‌هاي دهه 1960 رواج یافت و به عفونت‌هایي گفته مي‌شوند که پس از 48 تا 72 ساعت بستري در بيمارستان آشکار مي‌شوند. علائم عفونتهای بيمارستاني ممکن است در بيمارستان يا پس از مرخص شدن از بيمارستان آشکار شوند(18).

اگر چه با مصرف آنتي‌بيوتيک‌ها، ميزان مرگ و مير ناشي از عفونت‌هاي بيمارستاني به شدت کاهش يافته است اما همزمان با آن میزان عفونت‌هاي بيمارستاني کاهش پیدا نکرده است. بيمارستان‌ها منبع مهمي از پاتوژن‌هاي فرصت طلب و بيماري زا هستند(18).

به طور کلي هر میکروارگانیسم موجود در بيمارستان مي‌تواند منشأ عفونت باشد، اما غالب عفونت‌ها توسط باکتری‌های پاتوژن فرصت طلب خانواده انتروباکترياسه ايجاد مي‌شوند. مشکل عمده، ميکرو ارگانيزم‌هايي هستند که خاصيت بيماري زايي پاييني داشته و به عنوان ساپروفيت محسوب مي‌شوند ولي در هنگام کاهش قدرت سيستم ايمني ميزبان، بخصوص در افراد مسن و کودکان مي‌توانند سبب عفونت بيمارستاني شوند. عوامل ايجاد عفونت بيمارستاني به ترتيب اهميت شامل باکتري‌هاي گرم منفي حدود50%، باکتري‌هاي گرم مثبت حدود 40% و قارچ‌ها حدود 9% و در نهايت ويروس‌ها در حدود 1% موارد عفونت بيمارستاني را شامل مي‌شوند(1).

در خلال دهه گذشته استافیلوکوکهای کوآگولاز منفی[1](CNS یا CoNS ) یکی از مهمترین عوامل عفونتهای بیمارستانی، باکتریمی، اندوکاردیت، عفونت زخم، عفونت ادراری، پنومونی، عفونت پوست و بافت نرم و سایر عفونتها به شمار آمده و همچنین در سالهای اخیر بروز اپیدمی استافیلوکوکی از چندین بیمارستان در دنیا گزارش گردیده است. در بسیاری اوقات این باکتریها به عنوان سومین عامل عفونت بیمارستانی مطرح شده اند(2،19).

این باکتریها عموماً به عنوان بخشی از فلور طبیعی بدن انسان شناخته مي‌شوند ولی به دلیل استفاده گسترده از آنتی بیوتیکها برای درمان یا پیشگیری، به عوامل ضدمیکروبی مختلفی مقاوم شده اند(20).

 

1ـ 2 تاريخچه باکتري استافيلوکوکوس

براي اولين بار رابرت کخ[2] در سال 1878 استافيلوکوکوس را از چرک بيماران جدا کرد و دو سال بعد پاستور[3] آن را در محيط کشت مايع کشت داد.

در سال 1881 الکساندر آگستون[4] ثابت کرد که اين ارگانيسم علاوه بر انسان براي موش و خوکچه هندي نيز بيماري زا است(21).

رزنباخ[5] در سال 1884 مشاهده کرد که استافيلوکوکوس ها بر روي محيط کشت جامد دو نوع کلني به رنگهای طلايي و سفيد تشکيل مي‌دهند بنابر این جنس استافيلوکوکوس را به دو گونه Staphylococcus aureus و Staphylococcus albus تقسيم بندي نمود.

پاستور به اين جنس گونه سومي تحت عنوان Staphylococcus citreus اضافه کرد و بدين ترتيب مبناي طبقه بندي بر اساس نوع آرايش و مورفولوژي و رنگ کلني قرار گرفت.

در سال 1914 اسکینر(Skinner)و کیفر(Keefer) با اعلام این که 82 درصد از مجموع 122 بيمار مبتلا به باکتريمي ناشي از اين باکتري مرده اند، قدرت بيماري زايي آن را نشان دادند(3).

آگستون نام استافيلوکوکوس را براي ميکروکوکوس‌هاي عامل عفونت التهابي و ترشحات چرکي به کار برد. پاستور مشاهده کرد که باکتري‌هاي کروي کوچک در چرک و استئوميليت وجود دارند و فکر کرد که اين باکتري‌ها احتمالاً عامل بيماری باشند، در واقع پاستور باکتري‌هايي که آگستون شرح داده بود را مشاهده کرده بود. زوف[6] استافيلوکوکها و گروهي از ميکروکوک‌هاي ساپروفيت که آرايش چهارتايي داشتند را تحت جنس ميکروکوک قرار داد.

فلاگ[7] جنس استافيلوکوک را از جنس ميکروکوک تفکیک کرد. اين تفاوت بر اساس توانايي هضم ژلاتين و ميزان وابستگي آن‌ها به ميزبان بود، به طوري که استافيلوکوک‌ها مي‌توانستند ژلاتين را هضم کنند، بنابراین به عنوان پارازيت و بيماري زا در نظر گرفته شدند و ميکروکوک‌ها که ذوب ژلاتين متغيري دارند ساپروفيت محسوب شدند. وان دارانئي[8] در سال 1925 اولين فردي بود که به ارزش انعقاد پلاسما به عنوان يک تست تشخيصي استافيلوکوکوس اورئوس پی برد. درسال 1930 ژوليانلی[9] اولين روش طبقه بندي استافيلوکوک را از روي ساختمان آنتي ژنيک معرفي کرد و در سال 1942 فيسک[10] روش فاژتايپينگ را معرفي کرد.

ايوان[11] و همکاران در سال 1955 استافيلوکوک‌ها را از ميکروکوک‌ها بر اساس مصرف گلوکز و نيازشان به اکسيژن و از طريق تست اکسيداسيون _فرمانتاسيون[12] (OF) جدا نمودند. بنابراين کوکسي‌هاي بي هوازي اختياري در جنس استافيلوکوکوس و هوازي‌هاي اجباري در جنس ميکروکوکوس قرار گرفتند. اما بعد از چندی مشخص شد که برخي از استافيلوکوک‌ها در محيط OF اسيد کمي توليد مي‌کنند و در نتيجه آزمايش منفي مي‌شود، در صورتي که برخي از ميکروکوک‌ها در شرايط بي هوازي، با استفاده از گلوکز به مقدار کافي اسيد توليد مي‌کنند تا نتيجه تست مثبت شود، بنابراین تست OF آزمون معتبري نيست و بهترين راه تشخيص دو جنس مزبور، بررسي ترکيب بازهاي DNA آن‌ها مي‌باشد.در سال 1961پري وت[13] بر اساس درصد بازهای آلی سیتوزین و گوانین استافیلوکوک و میکروکوک را از یکدیگر تفکیک کرد، بدین نحو که کوکسي گرم مثبتی که کاتالاز مثبت باشد وDNA آن حاوي 39ـ 30 درصد G+Cباشد مشخص کننده استافيلوکوک است در حالي که G+C ميکروکوک‌ها 73ـ 67 درصد است(21).

 

1ـ 3 جنس باکتري استافيلوکوکوس:

درخانواده میکروکوکاسه فقط جنس استافيلوکوکوس در پزشکي اهمیت دارد. نامگذاری استافیلوکوکوس‌ها به دليل شکل و آرايش ويژه آنهاست. استافيلوکوکوس از دو کلمه یونانی استافيل (به معني خوشه انگور) و کوکوس (به معناي کروي) تشکيل شده و در مجموع استافيلوکوکوس به معناي باکتري کروي با آرايش خوشه انگور است. نامگذاری گونه اپیدرمیدیس (به معنی پوست خارجی)، برگرفته از کلمه اپیدرمیس یا پوست خارجی است. همچنین گونه ساپروفیتیکوس از واژه ساپروفیتیک (عاملی که روی بافت مرده رشد مي‌کند) گرفته شده است که ساپروس به معنای فاسد و فایتون به معنای گیاه است (5).

خصوصیات کلی این جنس بدین قرار است: شکل کروي يا بيضي، قطر 5/. تا 5/1 ميکرومتر، گرم مثبت، داراي آرايش خوشه انگوري(اما برخي سلول‌ها به صورت تکي، دوتايي و زنجيره اي کوتاه)، فاقد فلاژل و بدون تحرک، بدون اسپور، بعضي از سويه‌ها داراي کپسول و هوازي يا بي‌هوازي اختياري(البته در شرايط هوازي رشد بهتري دارند). گونه‌هاي بي‌هوازي استافيلوکوکوس ساکروليتيکوس و زير گونه‌هاي آن ونيز استافيلوکوکوس اورئوس زير گونه آنئروبيوس استثناء هستند (22،23).

اين باکتري‌ها همچنين توانايي اکسيد يا تخمير کربوهيدرات‌هاي مختلف را دارند. استافيلوکوک‌ها کاتالاز مثبت و کموارگانوتروف هستند. متوسط زمان تکثير اين باکتري حدود بيست دقيقه است. برخي داراي پيگمان و برخي فاقد پيگمان هستند و توليد پيگمان ارتباط قطعي با بيماري زايي ندارد. امروزه براي تعيين گونه‌هاي پاتوژن، توانايي توليد کواگولاز جايگزين توليد پيگمان شده است (21،22).

در این دسته، استافیلوکوکوس اورئوس با تولید فاکتورهای ویرولانس متعدد، بیماریزا محسوب شده و کوآگولاز نیز تولید مي‌کند که منجر به انعقاد پلاسما شده و باعث مصون ماندن باکتری از عملکرد سلولهای دفاعی بدن می شود. انواع کوآگولاز منفی استافیلوکوکها (CoNS) اغلب در میان پستانداران به عنوان همزیست هستند و تاکنون حدود 40 گونه از اینها شناسایی شده و نزدیک به 17 گونه شان با انسان در ارتباط هستند که معمولاً غیر همولیتیک‌اند(10). استافیلوکوکهای کوآگولاز منفی به طور برجسته ای در طی دهه‌های گذشته بیماریزا شده‌اند و دلیل آن استفاده گسترده از آنتی بیوتیکها برای درمان یا پیشگیری بوده است و آن سویه‌های CoNS که از طریق بیمارستان کسب شده‌اند به عوامل ضدمیکروبی مختلفی مقاوم شده‌اند(20).

CNS جزو فلور طبیعی پوست هستند که مي‌توانند در مخاط بینی و مجاری تنفسی و همچنین در تجهیزات پزشکی مستقر شوند و چسبیدن این باکتریها به سطح کاتترها و سایر تجهیزات مثل دریچه قلب و ایمپلنتهای ارتوپدیک و توانایی بقای آنها بر روی مواد بیولوژیک به عنوان اولین مرحله در عفونتهای خون ناشی از کاتترها مطرح می شوند(2).

تقریبا 75 درصد از این عفونتها توسط استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس ایجاد مي‌شوند. عفونتهای ناشی از استافیلوکوکوس لاگدوننسیس، استافیلوکوکوس وارنری، استافیلوکوکوس هومینیس و سایر گونه‌ها کمتر رایج هستند. استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس یکی از عوامل نسبتا رایج عفونت دستگاه ادراری در زنان جوان مي‌باشد، اگر چه این گونه در بیماران بستری در بیمارستان نیز عفونت ایجاد مي‌کند(4).

 

جدول 1ـ 1) نحوه کلونيزاسيون و بيماريزائي استافيلوکوکوس در انسان (4)

 

گونه‌ها	کلونيزسيون در انسان	بيماري در انسان
استافيلوکوکوس اورئوس استافيلوکوکوس اپيدرميديس استافيلوکوکوس ساپروفيتيکوس استافيلوکوکوس کاپيتيس استافيلوکوکوس هموليتيکوس استافيلوکوکوس لوگدوننسيس استافيلوکوکوس ساکاروليتيکوس استافيلوکوکوس وانري استافيلوکوکوس هومينيس استافيلوکوکوس گزيلوزوس استافيلوکوکوس سيمولانس استافيلوکوکوس کوهني استافيلوکوکوس کاپره استافيلوکوکوس پاستوري استافيلوکوکوس شليفري استافيلوکوکوس اوريکولاريس	شايع شايع شايع شايع شايع شايع شايع شايع شايع شايع شايع شايع غير شايع غير شايع نادر شايع	شايع شايع شايع شايع غيرشايع غيرشايع نادر نادر نادر نادر نادر نادر نادر نادر نادر نادر

1ـ 4 طبقه بندي

استافيلوکوکوس ها داراي 40 گونه و 15 زير گونه مي‌باشند که از اين تعداد 17 گونه با بيماري در انسان مرتبط هستند (22). در بين گونه‌هایي که برای انسان بيماري‌زا هستند 3 گونه داراي اهميت پزشکي و بالینی مي‌باشند که عبارتند از:

استافيلوکوکوس اورئوس

استافيلوکوکوس اپيدرميديس

استافيلوکوکوس ساپروفيتيکوس

 

جدول 1ـ 2) مقايسه خصوصيات سه گونه استافيلوکوکوس مهم پزشکي (22)

 

گونه‌ها	هموليز	کاتالاز	کوآگولاز	پروتئين A	نيازبه بيوتين	نووبيوسين
استافيلوکوکوس اورئوس	بتا	مثبت	مثبت	دارد	ندارد	حساس
استافيلوکوکوس اپيدرميديس	متغير	مثبت	منفي	ندارد	دارد	حساس
استافيلوکوکوس ساپروفيتيکوس	متغير	مثبت	منفي	ندارد	ندارد	مقاوم

 

جنس ميکروکوک نيز به 6 زير گروه تقسيم مي‌شود که ميکروکوک، کوکيوريا و کايتوکوک به طور معمول در سطح پوست انسان کلونيزه مي‌شوند. اين کوکوس‌ها شبيه استافيلوکوک بوده و امکان دارد با استافيلوکوک‌هاي کواگولاز منفي اشتباه شوند. اگر چه ممکن است اين باکتري‌ها در انسان عفونت‌هاي فرصت طلب ايجاد کنند ولي جداسازي آن‌ها در نمونه‌هاي باليني به طور معمول بيانگر آلودگي مي‌باشد (25).

 

1ـ 5 مورفولوژي سلول

در رنگ آميزي گرم از کشت تازه (24ـ 18ساعت)، استافيلوکوک‌ها گرم مثبت هستند و زير ميکروسکوپ نوري به شکل کروي با اندازه اي حدود 5/1ـ 5/ ميکرومتر ديده مي‌شوند. کشت کهنه اين باکتري(بيش از48ساعت) اغلب گرم متغير و متمايل به گرم منفي خواهد شد. تقسيم سلولي استافيلوکوک‌ها در بيش از يک سطح صورت مي‌گيرد و معمولاً در سه محور بوده که منجر به تجمع نامنظم از سلول‌ها شبيه به خوشه انگور (Grapelike cluster) مي‌شود و به همين علت بر حسب گونه، آرايش‌های گوناگونی مثل خوشه اي، دوتايي، چهارتايي و رشته اي کوتاه پيدا مي‌کنند. اين خوشه‌ها در محيط کشت جامد بزرگ و در محيط کشت مايع کوچکتر و اغلب زنجيره کوتاه و دوتايي تشکيل مي‌دهند. در چرک تک تک، دو به دو، چهار به چهار و گاهي مانند خوشه‌هاي کوچک پهلوي يکديگر قرار مي‌گيرند(21).

 

1ـ 6 خصوصيات کشت

استافیلوکوکها بر روی اکثر محیط‌های باکتریولوژی و در شرایط هوازی و میکروآئروفیل رشد مي‌کنند. محيط‌هاي انتخابي براي رشد استافيلوکوک‌ها شامل بلادآگار، مانيتول سالت آگار، ليپازـ سالت مانيتول آگار، فنيل اتيل الکل آگار، برد پارکر آگار با تلوريت و زرده تخم مرغ و کلمبيا کلستين ناليديکسيک اسيد آگاراست. اين محيط‌ها مانع از رشد باکتري‌هاي گرم منفي می شوند ولي به استافيلوکوک‌ها اجازه رشد مي‌دهند(21).

برای جداسازي اوليه استافيلوکوک‌ها مي‌توان نمونه مورد نظر را در محيط کشت بلاد آگار حاوي 5% خون دفيبرينه گوسفند کشت داد و ايزوله نمود. در اين محيط پس از 24ـ 18 ساعت انکوباسيون در دماي 37ـ 35 درجه سانتي‌گراد، کلني‌هايي به قطر 3ـ1 ميليمتر به شکل مدور، صاف و با قوام خامه اي ايجاد مي‌گردد. استافيلوکوکوس اپيدرميديس در کشت اولیه کلنی‌های خاکستری تا سفید ایجاد مي‌کند.

از محيط بلاد آگار حاوي خون انسان جهت کشت استافيلوکوک نبايد استفاده شود زيرا خون انسان حاوي مهار کننده‌هاي غير اختصاصي و يا آنتي بادي‌ها است(25).

گونه‌های استافيلوکوکوس اپيدرميديس و استافيلوکوکوس ساپروفيتيکوس از نظر ایجاد همولیز متغیر هستند ولی هموليز بتا ترجيحاً مربوط به استافيلوکوکوس اورئوس مي‌باشد. اين خصوصيت نيز مانند توليد پيگمان يک ويژگي تغيير پذير در استافيلوکوک‌ها است. توليد پيگمان تنها در شرايط هوازي و محيط جامد امکان پذير است و در محيط مايع و شرايط بي هوازي پيگمان توليد نمي‌شود. بهترين دماي توليد پيگمان نيز 25ـ 22 درجه سانتي‌گراد مي‌باشد در حالي دماي اپتيمم رشد باکتري 37 درجه سانتي‌گراد است (23).

اين باکتريها مي‌توانند در دماي بين 45ـ 5/6 درجه سانتي‌گراد و اسیدیته 3/9ـ 3/4 رشد کند. دماي بهينه رشد آنها 37 درجه سانتي‌گراد و pH اپتيمم آن 5/7ـ 7 مي‌باشد (26،27). بهترين روش پيشنهاد شده براي تشخيص استافیلوکوکها، انکوباسيون 72 ساعته در دماي 37ـ 35 درجه سانتي‌گراد و سپس 48 ساعت نگهداري در دماي اتاق است. در اين شرايط کلني‌ها قطري حدود 10ـ 2 ميلي متر داشته و اغلب گونه‌ها را مي‌توان از روي خصوصيات کلني تشخيص داد(21،27).

معمولاً کلني‌هاي يک گونه از نظر اندازه، شکل لبه، پيگمان و غيره خصوصيات يکساني دارند. با اين وجود برخي از سويه‌ها داراي دو يا چند مورفوتايپ (Morpho type) مي‌باشند(21).

توليد پيگمان در محيط تريپتيکاز سوي آگار (TSA) معمولاً بارزتر از بلاد آگار است. برای کشت و همچنین کشت مجدد استافيلوکوک‌هايي که از سطح پوست بدست مي‌آيند مي‌توان از محیط TSA به همراه محيط آگار P استفاده کرد. روي اين محيط‌ها در مقايسه با آگار خون دار پيگمان بهتري تشکيل مي‌شود که بسته به نوع گونه به رنگ کرم، زرد یا نارنجي ايجاد مي‌شود. بسياري از گونه‌ها در محيط مايع کدورت يکنواخت ايجاد مي‌کنند(21).

چنانچه شرایط مناسب برای کشت رعایت نشود ممکن است در تشخیص باکتری خطا ایجاد شود چرا که، در حالت معمول کلنی‌های یک سویه از نظر اندازه، حاشیه، پیگمان و درخشش ظاهری به هم شباهت دارند و اگر بیش از یک کلونی برای تلقیح به محیط‌های افتراقی استفاده گردد ممکن است منجر به خطا در تشخیص شود و کلنی‌های مزبور به دو یا چند گونه، زیر گونه یا سویه‌های مختلفی تعلق داشته باشند و ارگانیسم‌های جدا شده عامل اتیولوژیک نباشند(25).

 

1ـ 7 متابوليسم

سطوح پوست انسان همواره مرطوب است و درکنار سایر فلور طبیعی، استافیلوکوکها بخصوص اپیدرمیدیس هم حضور دارند. اسيدلاکتيک و لاکتات موجود در سطح پوست، شرايط بافري مناسبی را فراهم کرده و منبع کربن بزرگي براي استافيلوکوک‌ها و ساير باکتري‌هاي مقيم پوست بشمار مي‌آيند. در این سطوح گلوکز و دیگر قندها به میزان کمی وجود دارند، همچنین ممکن است میزان گلوکز در برخی بافت‌ها مثل خون، کلیه، کبد و عضله بیشتر باشد. از آنجا که گلوکز، کربوهیدرات اصلی مورد استفاده برای رشد استافیلوکوکوس‌هاست ممکن است بتواند به این بافت‌ها حمله کند و البته گلوکز تنها منبع کربن برای رشد این باکتری محسوب نمی شود. مسیرهای گلیکولیز و هگزوز منو فسفات، دو راه متابولیسم گلوکز برای استافیلوکوکوس‌ها مي‌باشند. استافیلوکوکوس گلوکز را اساساً از راه گلیکولیز و به میزان کمی از راه هگزوز منو فسفات متابولیزه مي‌نماید. محصول کاتابولیسم گلوکز در شرایط هوازی، اسید لاکتیک همراه با مقادیر کمی گاز کربنیک است و در شرایط بی هوازی اسید لاکتیک همراه با مقداری استوئین تولید مي‌شود. به عبارتی استافیلوکوکوس‌ها انرژی را از هر دو طریق مسیرهای تنفسی و تخمیری به دست مي‌آورند. در شرایط مناسب رشد هر یک از مسیرهای گلیکولیز، از قبیل پنتوز فسفات وچرخه اسید سیتریک فعال هستند (25).

 

1ـ8 تنفس

استافيلوکوکوس‌هايي که در شرايط هوازي رشد مي‌کنند آنزيم کاتالاز را توليد مي‌کنند که این آنزیم آب اکسيژنه را به مولکولهای آب و اکسیژن تجزیه کرده و مانع تجمع اين ماده سمي در باکتري مي‌شود. سيستم انتقال الکترون در استافيلوکوکوس ها شامل سيتوکروم‌ها و مناکوئينون‌هاي غيراشباع متصل به غشاء مي‌باشد. سيتوکروم‌هاي اصلي زنجيره تنفسي شامل سيتوکروم‌هاي o555، b557، a206 مي‌باشد.اگرچه به نظر مي‌رسد که سيتوکروم a نقش اساسي در تنفس، حداقل در برخي از استافيلوکوک‌ها را ندارد. مناکينون‌ها ي (mkـ 9 تا mkـ 6) تنها کوئينون‌هاي ايزوپرنوئيد استافيلوکوکي هستند و نقش مهمي در انتقال الکترون و فسفوريلاسيون اکسيداتيو دارند(21).

 

1ـ 9اپيدميولوژي

پوست و غشاهای مخاطی معمولاَ دارای میکروارگانیزم‌ها ی متنوعی هستند که مي‌توانند به دو گروه فلور ساکن پایدار و فلور ناپایدار و گذرا تقسیم بندی شوند. اگر فلور ساکن به هر دلیلی از جمله آسیب ‌های پوستی، اعمال جراحی مثل تعویض یا دستکاری دریچه قلبی، تعویض مفاصل و کاشت سایر وسایل مصنوعی در بدن تخریب شود، میکروارگانیزم‌های گذرا که غیر پاتوژن یا پاتوژن‌های بالقوه هستند ممکن است کلونیزه شده و تکثیر یابند و سبب ایجاد بیماری شوند. بروز بیماری بدین صورت و یا در افراد مسن و ضغف ایمنی، ممکن است با قرار گرفتن فلور طبیعی یک قسمت از بدن در محلی غیر از سکونت گاه طبیعی خود نیز ایجاد شده و باعث بروز مشکلات فراوان شود. استافيلوکوک‌ها در همه جا پراکنده‌اند ولی استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و سایر استافیلوکوکوس‌های کوآگولاز منفی به همراه اورئوس (در تعداد کم)، گونه‌های میکروکوکوس و چندین گونه دیگر باکتریایی جزو فلور ساکن پوست هستند، همچنین استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به میزان قابل توجهی در بینی و حلق حضور دارد. گونه‌های استافیلوکوک در کنار میکروب‌هایی همچون اکتینومایسس‌ها، لاکتوباسیلها، باکتروئیدها، کلستریدیوم‌ها و غیره به عنوان فلور طبیعی در دستگاه ادراری _ تناسلی حضور دارند(4).

دربینCoNS ، بیشترین گونه ای که جدا مي‌شود استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس است که اغلب عامل عفونتهای بیمارستانی و مخصوصاً عفونت وسایل پزشکی بکار رفته در بدن است. اين باكتري ظرفیت ایجاد بیوفیلم چندلایه با ساختار محکم در سطح وسایل مصنوعی دارد كه همین عامل باعث مقاومت هزار برابری جمعیتهای چسبیده این باکتری به درمان مي‌شود، تا جایی که راهکار آخر و اساسی درمانی عفونتهاي ناشي از اين باكتري برداشتن وسیله بکار رفته در بدن مي‌باشد (28،29).

استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس نيز یکی دیگر از گونه‌های شایع CoNS است که بعد از اشرشیا کلی دومین عامل عفونت ادراری در زنان جوان و میانسال، بخصوص با فعالیت جنسی بالا مي‌باشد و با مقاومت به آنتی بیوتیک نووبیوسین از استافیلوکوک اپیدرمیدیس تفکیک مي‌شود. بر خلاف سایر CoNS، مقاومت به آنتی بیوتیکهای موثر بر کوکسی‌های گرم مثبت از جمله متی سیلین در این باکتری کمتر دیده شده است (30).

استافيلوکوک‌ها به دماهاي بسيار بالا و همچنين مواد ضدعفوني کننده و آنتي‌سپتيک حساس مي‌باشند. اما اين ارگانيسم‌ها مي توانند براي مدت طولاني در سطوح خشک زنده بمانند. منشاء عفونت استافيلوکوکي يک بيمار، عضوي از کارکنان پزشکي يا يک ضايعه استافيلوکوکي است. بيماراني که مبتلا به ضايعاتي باشند که در آن‌ها تراوشات چرکي وجود داشته باشد مسری و خطرناک هستند (25).

 

1ـ 10 خصوصيات ژنتيکي

قابلیت تغییر ژنتیکی بالا در استافيلوکوک همواره باعث بروز اشکال در شناسايي استافيلوکوکوسها بخصوص اورئوس مي‌باشد. اهميت اين انعطاف پذيري در علم پزشکي تا مدت‌ها ناشناخته بود تا اين که به طور ناگهاني سوش‌هاي مقاوم به پني سيلين و پس از آن ظهور سوش‌هاي مقاوم به ساير داروها چشمگیر شد. مشکلات عديده درماني و اپيدميولوژي که به توسط اين سوش‌هاي مقاوم در برابر دارو به وجود آمد لزوم انجام مطالعات ژنتيکی را بر روي استافيلوکوک آشکار کرد (25).

 

[1]- Coagulase Negative staphylococci

[2]- Robert Koch

[3]-Pastur

 

[4]- Ogston

[5]-Rosenbach

[6]- Zopf

[7]-Flugge

[8]- Von Daranyi

[9]-Julianelie

[10]-Fisk

[11]-Evan

[12]-Oxidation - Fermentation

[13]- Prevot